络绎学术Online直播第12期，我们邀请到了浙江大学教授、博士生导师平渊教授为我们分享基因编辑非病毒载体在疾病治疗中的应用。
基因编辑技术(genomeediting)可以精确地破坏、插入或替换基因组中特定位点的DNA序列,在基因功能的研究和遗传疾病的治疗中发挥着巨大的作用。人工核酸内切酶(engineeredonuclease,EEN)介导的基因编辑技术极大地改善了早期基于同源重组的基因打靶技术(genetargeting)效率低的问题,使得科研工作者可以高效地对各种细胞类型和生物的任何基因进行编辑。
目前，归巢核酸内切酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(zincfingernucleases,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白这4类工具酶，在基因编辑技术中应用最多。
无论是ZFN、TALEN还是CRISPR/Cas9，它们都是由DNA识别域与核酸内切酶两部分组成，在结构上具备相似性。其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区域是典型串联TALE重复序列的中央结构域，DNA剪切区域是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域就是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。
在作用过程上，它们也具有相似性。通过DNA识别模块对特异性的DNA位点识别并结合，然后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切，从而借助于细胞内固有的HDR或NHEJ途径修复过程完成特定序列的插入、删除及基因融合。
通过和与其他技术的多方面对比，我们可以看到CRISPR/Cas9技术既有优势，也有限制。那么CRISPR/Cas9技术的前世今生又有什么样的故事呢？
基因编辑“魔剪”——CRISPR
1987年，日本微生物学家石野良纯首次发现CRISPR。2012年ScribeTherapeutics公司创始人之一JenniferDoudna博士与EmmanuelleCharpentier博士利用CRISPR完成基因编辑。CRISPR被认为是21世纪最重要的发现之一，于2012年、2013年、2015年3次入选Science评选的“世界十大科学突破”。
规律成簇的间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatssequences,CRISPR)是能为细菌和古生菌提供对病毒和质粒的适应性免疫的DNA重复序列。CRISPR基因序列主要由前导序列(leader)、重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)构成。2002年，Jansen实验室将临近CRISPRlocus的基因命名为cas(CRISPR-associated)，并发现了4个cas基因(cas1,cas2,cas3,cas4)。
CRISPR/Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的DNA里一个称为CRISPR的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。
CRISPR系统有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中CRISPR/Cas9作为Ⅱ型研究最多，是继锌指核酸内切酶(zincfingernuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)之外出现的第3代基因编辑技术，其介导的基因编辑可用于生成转基因模型、调节转录、调控表观遗传等。
CRISPR/Cas9系统主要是由Cas9蛋白和单链向导RNA(sgRNA)组成，其中Cas9蛋白具有切割DNA双链功能，sgRNA起导向作用。在原型间隔区相邻的基序(protospaceradjacentmotif,PAM)存在的情况下，Cas9蛋白能在sgRNA导向作用下通过碱基互补配对到达不同的靶部位，切割靶基因实现DNA双链断裂(doublestrandbreak,DSB)。
CRISPR/Cas9技术工作中的3个关键因素
向导RNA：定位目标基因的一部分RNA。这是在实验室中设计的；
CRISPR相关蛋白9(Cas9)：剪掉不需要的DNA片段的“剪刀”；
供体DNA：原DNA链被剪断之后插入的所需的DNA片段。
DSB修复主要有两种机制，分别是非同源末端连接修复NHEJ和同源重组修复HDR。非同源末端连接(non-homologousjoining,NHEJ),NHEJ介导的修复可在DNA双链断裂位点产生不精确的可变长度的插入和/或删除突变。其它的非同源重组修复途径也是存在的，比如微同源末端连接(MMEJ,Microhomologymediatedjoining)和单链退火途径(SSA,Single-strandannealing)。
非同源修复的三种途径NHEJ、MMEJ和SSA的区别较为明显。
/NHEJ途径修复DSB损伤是通过末端直接相连的方式进行的，这种连接不需要大片段的同源序列识别，而只需要1-5bp的碱基配对就可以进行修复，属于一种易错修复。
/与NHEJ修复途径比较，MMEJ修复与其最大的差别在于所识别的同源序列长度的不同。MMEJ修复途径需要5-25个碱基同源序列，会常常造成连接处发生同源片段的缺失或者基因重排。这也属于易错修复。
/与NHEJ和MMEJ途径相比较，SSA途径需要更长的同源序列(30bp)来进行识别。SSA途径可以导致基因组的缺失，这是其与MMEJ途径所类似之处。此外，SSA与同源重组途径类似，也被归属为同源序列依赖型的DSB修复模式，两者都需要通过5’到3’的DNA剪切，产生3’突出的单链DNA。
同源重组修复(homology-directedrepair,HDR)，HDR介导的精确修复可以从单链或双链DNA供体模板引入精确的点突变或插入突变。“同源重组”机制在双链DNA修复中具有十分重要的细胞生物学意义。DNA同源重组修复是一条涉及到多个步骤的复杂的信号通路，其中关键蛋白为BRCA1和BRCA2。如果BRCA基因出现突变导致BRCA1和BRCA2蛋白失去功能，就会引起HRD功能异常(HomologousRecombinationDeficiency,HRD)和PALB2,CDK12,RAD51,CHEK2,ATM等相关基因突变、或BRCA1基因启动子发生甲基化导致基因组不稳定。当同源重组发生错误识别时，在非模板染色体执行“修复”可能会给细胞带来无法预估的伤害。比如，错误的识别来自另一个亲本的同源物，而不是姐妹染色单体作为模板来“修复”损伤的染色体。母本和父本染色体在许多位置上的DNA序列是不同的，因此，这种类型的修复可以将需要修复的DNA序列从母本转变为父本序列，或从父本转变为母本序列。
由于CRISPR具有简单、廉价和高效等优势，因此它已经成为全球最为流行的基因编辑技术，被称为编辑基因的“魔剪”。科学家通过它可以高效、精确地改变、编辑或替换植物、动物甚至是人类身上的基因，经过改造的CRISPR技术可被广泛地应用于生物医药和其他领域。
CRISPR技术应用前景广阔，在医疗、能源、农业、工业等领域有望大放异彩
开发新的诊断测试，靶向药物和治疗方法。通过将CRISPR与其他可切割目标DNA或RNA的Cas蛋白配对，然后切割其他分子以产生视觉信号，科学家可以确定何时存在病毒成分。科学家正在使用这项技术来开发诊断测试，以快速识别出诸如COVID-19之类的疾病。CRISPR/Cas9正在测试用于某些疾病的可能治疗方法，包括镰状细胞性贫血和某些类型的癌症。CRISPR也可用于通过改变昆虫或其他可传播疾病的生物的特性来帮助控制某些疾病。例如，科学家使用CRISPR使蚊子对引起疟疾的寄生虫更具抵抗力。
开发生物燃料。基因编辑可以提高藻类生物燃料的产量。利用CRISPR/Cas9技术，科学家能够找到并移除限制脂肪产生的基因。致力于研究商业化基因组学解决方案以解决全球能源与环境问题的美国生物技术公司SyntheticGenomics已经创造出了能产生两倍脂肪的藻类，然后用于生产生物柴油。迄今为止，藻类尚未产生足够高水平的脂肪以支撑生物柴油的大规模量产。通过CRISPR/Cas9技术，藻类将二氧化碳转化为生物燃料的效率有望大幅提高。SyntheticGenomics目前正与石油公司埃克森美孚(ExxonMobil)合作。预计此次合作将实现到2025年，每天生产10,000桶（石油计量单位，每桶相当于120-159升）藻类生物燃料的目标。
更强壮，更抗病的农作物。CRISPR可以通过增加营养成分，抗病性和在恶劣天气和土壤条件下的生存能力来改善农产品。在传统作物改良上，CRISPR技术能带来产量、品质、抗病性和抗除草剂性等方面的提升。在农业育种和加速作物驯化方面，CRISPR与其他技术的联用的创新层出不穷。目前，CRISPR技术广泛应用于模式植物（拟南芥、烟草）和一些主要农作物，比如我们常见的水稻、小麦、玉米等。CRISPR技术也促进了植物基因功能研究和预期农艺性状的选择。例如，当研究人员删除一小部分特定的黄瓜基因时，这些植物就不太容易受到已知会损害植物并造成严重农作物损失的病毒的侵害。CRISPR基因编辑发明专家张锋教授、DavidLiu先生和KeithJoung先生共同创立了一家名为Pairwise的新型农业公司。该公司致力于利用基因编辑技术，以新的方式利用农作物的自然多样性来应对全球粮食挑战。
更先进的工业产品。各个行业都在探索CRISPR潜在用途。除了开发新的生物燃料意外，可以解救环境灾难的细菌以及新材料也是工业产品与CRISPR技术联用的主要方向之一。专注于CRISPR的非治疗应用的创新技术公司CaribouBioscience就提供了基于CRISPR的工具用以改善工业发酵过程，革新化学品和酶的生产过程。他们还用CRISPR操纵微生物，生产新的化学品。潜在的新型生物材料包括香精、香精和工业清洁产品。
CRISPR基因编辑也引起了人们对其安全、道德和监管这三方面的关注
安全问题。使用CRISPR可能会带来意想不到的后果。例如，它可以靶向DNA内的“意外”位置，从而产生可能导致疾病或其他伤害的变化。尽管一些研究表明错误可能很少见，但仍然有待研究。此外，CRISPR活性可能使细胞受压并阻止编辑。虽然某些细胞可以在DNA改变后恢复，但很多细胞是不能恢复的。
道德问题。伦理问题包括CRISPR是否将用于增强人类特征，例如增加的肌肉质量、学习能力和记忆力，以及是否可以公平地利用所有人群等。使用CRISPR编辑人类繁衍的影响也引发了伦理学问题。例如，遗传变化会在多大程度上影响子孙后代，是否应该允许对人类胚胎进行研究等。
监管挑战。许多国家在如何规范CRISPR和其他基因编辑技术的问题上难以决断。例如，在美国，目前尚不清楚基因编辑的作物是否将受到与常规转基因(GM)生物相同的法规的约束。虽然FDA在2017年就开始寻求有关其监管政策的公众意见，但是针对这一技术的行业新指南迟迟未发布。而在欧洲，2018年的一项法院裁决确定，基因编辑作物将与转基因植物受同样的法规约束。有关基因编辑技术的监管仍然存在诸多问题有待解决。
病毒载体
病毒是一类能对人体细胞及其它动物细胞进行有效感染的微生物。病毒的本领是把自己的基因高效地导入到宿主细胞里去，具有良好的基因递送效能。因此，病毒被科学家们改造成为进行基因治疗的主要递送工具。在基因治疗中使用最广泛的病毒载体包括逆转录病毒(retrovirus,RV)和慢病毒(lentivirus,LV)、腺病毒(adenovirus,Adv)以及腺相关病毒(adenoassociatedvirus,AAV)等载体。
逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。
慢病毒属在分类上属于逆转录病毒科，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主，导致感染个体发病。慢病毒载体是一种单链RNA病毒，目前较为常用的病毒系统是四质粒系统。与其他逆转录病毒相比，慢病毒载体具备宿主更广泛、对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，稳定表达和经过构建后可携带大约5kb及更长的目的基因的特点。
腺病毒是无胞膜的线性双链DNA病毒，目前腺病毒科分为5个属。在临床和科研中，主要使用的是Adv5型腺病毒载体。腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，属于非整合型的病毒载体，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。腺病毒载体还具备宿主范围广、对人致病性低、在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因、有效增殖滴度高、无插入致突变性、能在悬浮培养液中扩增、能同时表达多个基因的特点。
目前病毒载体仍然是临床试验的主流载体。病体载体的优点是转染效率高，但是缺点则包括特定人群无法使用、包装容量有限、免疫原性强和缺乏组织靶向性等。其中，慢病毒宿主范围广,基因容量大，感染效率高,能整合基因到宿主细胞，实现长期稳定表达，常构建稳定株；腺相关病毒免疫原性低，多种血清型，体内扩散能力强，常用用于体内研究；腺病毒携带外源基因片段大，感染效率高，主要用于体外难感染的细胞。
当然，其他类型的病毒载体也有很多，比如牛痘苗病毒(vacciniavirus,VV)、单纯孢疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)、噬菌体载体等。以HSV病毒为例，HSV病毒的滴度高、宿主范围广、外源基因容量大、对神经细胞具有特异性，但其毒性和免疫原性等因素有待进一步验证。因此，HSA病毒载体并未被广泛应用。
非病毒载体
非病毒载体的使用原理是采用人工合成的载体材料的物理化学性质来介导基因的转移。与病毒载体相比较，非病毒载体具有安全性高、包装尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控的优点，相对于病毒载体，非病毒载体成本较低、制备更简单，便于大规模生产。在表达反义寡核苷酸等特殊外源基因片段中，病毒载体有着传统病毒载体不可替代的作用。
目前，正在研究的非病毒载体主要包括脂质体、分子偶联受体、聚合物（聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺等）、复合载体以及纳米粒子载体等。常用的基因转移脂质体包括阳离子、中性和阴离子脂质体，其中阳离子脂质体研究的最为广泛；而应用于基因转移的无机纳米粒子主要包括硅、碳纳米管、铁氧化物等，它们主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生物体中而起到治疗疾病的作用。虽然非病毒载体仍存在转染效率较低等问题，但是他们在基因治疗领域扮演者越来越重要的角色。
以基于脂质、类脂质的非病毒载体为例。阳离子脂质和类脂质载体可以借助静电相互作用装载核酸。目前这类非病毒载体microRNA、siRNA和shRNA等的递送中得到了较为广泛的应用。同理它们也可递送基于质粒DNA、mRNA、RNP的CRISPR/Cas9系统。很多结构新颖、性能优良的脂质和类脂质材料被设计出来用于载体构建,这些载体往往需要PEG修饰。脂质载体经过PEG修饰实现长循环，通过被动靶向作用可蓄积于肿瘤组织，对其进行配体修饰或对脂质进行结构改造可以增强载体的靶向性,促进细胞摄取，提高递送效率。这类载体在屏蔽载体正电荷,减少蛋白吸附后，其循环稳定性也得以提高，更能达到人体给药的要求。
高分子聚合物由短链重复单元聚合而形成。重复单元的结构高度可控的特点让高分子聚合物可以根据所载物质的响应性需求被进行精确的设计。在结构上的多样性和功能上的全面性让高分子聚合物在递送pDNA时的可能性更加宽阔。
常用于递送蛋白质的纳米载体包括胶体纳米颗粒（如脂质体和固体脂质纳米颗粒）、聚合物纳米材料（如聚合物膜、纳米胶囊以及胶束）、无机纳米载体（如碳纳米管、量子点、介孔二氧化硅、磁性纳米颗粒、金纳米颗粒、金属有机框架、黑磷纳米片）等。磁性纳米颗粒可以作为磁共振成像的造影剂；金纳米颗粒可以产生光热效应；量子点颗粒可以进行示踪成像；还有些纳米颗粒可同时搭载药物与基因。这类非病毒载体不仅能将基因药物有效递送入细胞内，也能通过外部干扰达到最佳的抑癌作用。
非病毒载体虽然优点明显，但是非病毒载体在CRISPR/Cas9系统递送过程中仍存在不少问题，比如在如何免受网状内皮系统(reticuloothelialsystem,RES)的识别及清除、如何实现该纳米粒子在特定位置的富集、如何穿越由磷脂双分子层所构成的呈疏水性的细胞膜等。
可溶微针辅助基因治疗，递送糖皮质激素类药物呈现新路径
浙江大学药学院平渊教授团队采用高特异性靶向NLRP3的Cas9核糖核蛋白(RNP)基因编辑技术，并以高效的经皮微针给药糖皮质激素的方式有效治疗炎症性皮肤病(ISDs)，该研究以题为"Microneedle-assistedgenomeediting:AtransdermalstrategyoftargetingNLRP3byCRISPR-Cas9forsynergistictherapyofinflammatoryskindisorders"的论文发表在Science子刊《ScienceAdvances》上。这一研究成果让可溶性微针贴片基因编辑治疗走进了人们的视野。
炎症性皮肤病(ISDs)是最顽固的疾病之一，其特征通常是通过产生促炎细胞因子来激活先天性和适应性免疫应答。银屑病和特异性皮炎(AD)等炎症性皮肤病日益流行，成为威胁公共健康的主要问题之一。目前，患者仅能从少数的药物中选择治疗方案，尽管糖皮质激素和免疫抑制剂是一线治疗方案，但是经长期治疗后大多数患者对糖皮质激素产生耐药性，治疗效果有限。因此，研发替代性的治疗选择是为糖皮质激素产生耐药性的患者提供医疗方案的一个重要突破点。
多数研究表明NLRP3激活与糖皮质激素耐药性之间存在很强的相关性，虽然干扰激活NLRP3上游的相关因子起间接作用以达到治疗目的的小分子抑制剂相关研究众多，但是口服后，能够到达皮下层的药物含量十分有限，并未达到高效的治疗目的。因此提高安全性和有效性成了这一研发方向上的重中之重。
平渊教授团队开发的可溶性微针(MN)贴剂，微针中包封有靶向NLRP3的Cas9核糖核蛋白(RNP)的纳米复合物，以及含有地塞米松(Dex)的纳米复合物。当扎入皮肤后，微针可以快速溶解释放两种纳米复合物，随后被角质细胞和周围的免疫细胞内化，从而有效治疗皮下层炎症。微针能透皮递送Cas9RNP和Dex纳米复合物，破坏皮下细胞内NLRP3炎性小体，与Dex协同治疗作用下能有效治疗特异性皮炎(AD)和银屑病。
在筛选出sgRNAs序列时，发现CMAX（一种商用转染试剂）介导的和3T3细胞中对NLRP3基因位点进行编辑，Indel效率高达35.4%和32.5%，且也经过Sanger测序证实。此外，实验发现在细胞中添加PLGA/Dex纳米复合物后，NLRP3基因组位点的Indel效率从29.6%提高到36.2%。3T3细胞中，Indel效率也从19.1提高到31.7%。结果证实，Dex纳米复合物中的PLGA可能会扩张核孔，促进Cas9进核，提高对NLRP3基因位点的编辑活性。
通过微针介导的分级递送经皮治疗策略，可最大限度地发挥基因编辑和糖皮质激素协同治疗的治疗效果。这一方法不仅在炎症性皮肤病的治疗方面极具潜力，而且也为经皮给药和基因编辑疗法的联用提供了新的思路。
由于目前非病毒载体基因治疗领域的研究还是大多是在体外进行的，且体内外结果有一定差异。因此未来非病毒载体基因治疗的发展与体内研究将更加关联。
目前已经上市的非病毒产品代表
Neovasculogen
首个非病毒基因治疗产品，由俄罗斯人类干细胞研究所(HumanStemCellsInstitute)于2012年推出；由一个编码血管内皮生长因子(VEGF-165)的质粒载体组成；适应症：治疗严重肢端缺血。
Collategene
日本AnGes公司推出，已于2019年被批准适用于日本国民健康保险。Collategene由pVAX1-HGF组成，在人体内表达HGF728一种异构体。其主要适应症为治疗闭塞性动脉硬化症和血栓闭塞性脉管炎。
Spinraza(Nusinersen)
美国Biogen和Ionis制药联合开发，2017年经FDA批准上市。它通过与SMN2基因转录形成的mRNA相结合，改变RNA的剪接过程，从而增加正常SMN蛋白的表达量。因此，这一疗法可以在SMN1基因失活的SMA患者身上增加正常SMN蛋白的水平，从而维持运动神经元的生存。其主要适应症是治疗儿童和成人的脊髓性肌萎缩症。
非病毒和病毒载体均已实现用于各种应用的CRISPR/Cas9的递送。基因治疗也已经从基础研究向药物开发和工业化生产进行模式转变。基因治疗在治疗血液瘤和罕见病领域市场空间充足，未来可期。随着研发水平的提升和制备条件的改善，科学研究和临床需求的结合程度与转化流程的不断提升，未来在保险支付的支持下，基因治疗也终将有走进寻常百姓家的一天。
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