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类器官（Organoids）技术，是一种细胞培养的创新技术，采用三维（3D）培养形成具有类似真实器官的空间结构和部分功能的组织类似物。类器官是一项重大的技术突破，近年来成为热门的研究技术，被各大顶级期刊报道，在疾病建模、药物筛选、精准医疗、器官发育、再生医学等领域都有巨大的应用价值。目前已实现的类器官培养的器官类型众多，包括肠、肾、脑、肝、肺、皮肤、前列腺、胰腺和视网膜等。
图1：生物工程手段突破现有类器官瓶颈，形成下一代类器官[1]
虽然类器官的应用前景广泛，但技术在近十余年才集中发展，所以不少学者认为类器官要真正地进行临床应用，还将面临诸多挑战，其中就包括类器官的器官成熟度、一致性、获得性（即放大生产的可能性）和临床级操作流程。而采用生物工程技术是下一代类器官发展的突破途径[1-3]。如图1展示，这些工程手段包括了生物反应器（a）、可控的3D生物材料（b）、3D打印（e）、器官芯片（f）等等。
图2：部分已采用的生物反应器促进培养的类器官类型[2]
研究表明，类器官的结构复杂度和功能成熟度与类器官的大小有关，越大的类器官可形成越复杂的结构，通常大小可从200mm到4mm。但类器官越大，为类器官内部的细胞提供充足的营养物质和氧气就成为问题，而采用动态培养系统，如生物反应器则可以提供充足的营养物质和氧气的交换，促使大体积类器官的成熟和维持[4]。以下介绍几个采用搅拌式生物反应器制备类器官的研究。
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类脑器官
2013年，Lancaster在Nature上发表开创性研究，报道了具有共存但明确的不同大脑区域的类脑器官，这也是第一个使用类脑器官建立人类病例模型的工作[5]。先将多能干细胞以EB形式培养后，诱导分化成神经上皮组织进行培养，再将神经上皮组织包埋在Matrigel中，静止培养4天后转入搅拌式反应器进行培养，采用此种方式可以获得4mm大小、有效再现大脑结构的类器官。
图3：搅拌式反应器培养类脑器官[5]
2016年，Qian等研究者发表了一篇Cell文章，介绍使用微型搅拌式生物反应器，通过不同诱导分化培养基的添加，可培养出单一大脑区域的类器官，如前脑区域、中脑区域、海马体类器官并用于Zika病毒感染的研究[6]。该团队后来又发了一篇NatureProtocols，指导如何应用微型生物反应器进行类脑器官的培养，该文指出通过微型反应器可以实现200天以上的培养时长。
图4：微型反应器用于前脑、中脑、后脑、海马体类器官的形成[6]
2019年，Velasco发表的Nature文章，同样采用搅拌式生物反应器构建类脑器官。通过单细胞测序技术，研究者发现经过3-6个月培养，类脑器官的细胞多样性明显提升且与人类胚胎大脑皮层的细胞组分相近，并且单个类脑器官之间的细胞类型的形成过程是精确可重复的。
图5.类脑器官与人大脑皮层细胞多样性相似且单个类器官之间稳定再现[7]
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类视网膜器官
经典的视网膜类器官培养方法，是在2011由Eiraku等人发表于Nature，而随后多年视网膜类器官的培养方法基本沿用悬浮培养形式。2018年,Ovando-Roche等研究者发表了关于搅拌式反应器用于类视网膜器官培养的应用研究。他们的实验表明，生物反应器的使用改善了类视网膜器官层流分层的结构，并增加了具有纤毛和新生外节样结构的光感受器细胞的产生[8]。更进一步发现采用生物反应器培养降低了类器官的凋亡且促进了细胞的增殖。他们表示搅拌式反应器将有望加快视网膜细胞的培养，以便实际的临床应用。
图6.搅拌式生物反应器促进类视网膜器官的生成[8]
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类肝脏器官
与Lancaster发表类脑器官同年，Baharvand研究组发表了应用搅拌式生物反应器诱导多能干细胞往肝样细胞分化[9]的研究成果；2020年，又发表了类肝脏器官的研究成果，研究发现培养体系中的溶氧含量可以调控多能干细胞分化成类肝脏器官[10]，通过控制溶氧量在20-40%时，可促进多能干细胞往内胚层分化而进一步控制在30%时，能够有效分化成含有红细胞和具有功能肝细胞的类肝脏器官。
图7.通过搅拌式反应器控制氧溶量可调控类肝脏器官的形成[10]
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类肾脏器官
2018年，Przepiorski等人发表于StemCellReports的研究中采用了一种简单、廉价、好用的类肾器官培养方法[11]。该方法将多能干细胞经过8天的拟胚体形式培养形成管状结构后，转入125mL的搅拌式反应器中培养至26天，而在第14天时就已显示出最佳组织形态。通过与胎儿人类肾脏的比较，数据表明第14天的类器官组织与晚期毛细血管袢期肾单位最为相似。这个研究方案提供了一种快速、高效、成本效益高的方法，用于生成大量人类胎儿肾组织。
图8.一种采用搅拌式反应器悬浮培养多能干细胞的拟胚体和类肾器官的简单培养方法[11]
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结束语
搅拌式生物反应器已在部分类器官类型中展现出应用价值，助力类器官技术的发展。这个新兴领域的更多研究者都希望探索、借鉴、融合成熟的生物技术，以推动类器官的转化和应用，但如何拓展搅拌式生物反应器应用到更多类器官类型，还需要更多的探索。
由于类器官培养不易且昂贵，而传统搅拌式反应器容积较大，想要在研究初期阶段就广泛使用并不容易。类似Qian等开发的微型搅拌式反应器将是推动更多研究者探索生物工程技术和类器官技术结合的创新研究工具。Qian等开发的反应器尚未正式投入市场，且虽然体系小，但不能进行自动化控制，同时一个反应器也只能进行一组实验条件的验证。
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*参考文献：
[1]Manfrin,A.,Lutolf,(2018).
[2]Hofer,M.,Lutolf,,402–420(2021).
[3]Yin,X.,Mead,,Safaee,H.,Langer,R.,Karp,,Levy,O.(2016).,18(1),25-38.
[4]Silva,,Cotovio,,Bekman,E.,Carmo-Fonseca,M.,Cabral,J.,Fernandes,(2019).De,2019.
[5]Lancaster,,Renner,M.,Martin,,Wenzel,D.,Bicknell,,Hurles,,Knoblich,(2013).,501(7467),373-379.
[6]Qian,X.,Nguyen,,Song,,Hadiono,C.,Ogden,,Hammack,C.,Ming,(2016).Brain-regio,165(5),1238-1254.
[7]VelascoS,KedaigleAJ,SimmonsSK,cerebralcortex[J].Nature,2019,570(7762):523-527.
[8]Ovando-Roche,P.,West,,Branch,,Sampson,,Fernando,M.,Munro,P.,Ali,(2018).Useofbioreact,9(1),1-14.
[9]Vosough,M.,Omidinia,E.,Kadivar,M.,Shokrgozar,,Pournasr,B.,Aghdami,N.,Baharvand,H.(2013).Generationoffunctionalhepatocyte-lik,22(20),2693-2705.
[10]Farzaneh,Z.,Abbasalizadeh,S.,Asghari‐Vostikolaee,,Alikhani,M.,Cabral,,Baharvand,H.(2020).Dissolvedoxygenconcentrationregulateshumanhepaticorgano,117(12),3739-3756.
[11]Przepiorski,A.,Sander,V.,Tran,T.,Hollywood,,Sorrenson,B.,Shih,,Davidson,(2018).Asimplebioreact,11(2),470-484.
《自然·综述》：T细胞在衰老中的角色
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