王友军与合作者开发出新型光遗传学工具来干预疾病

注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

阿尔兹海默症（Alzheimer'sdisease,AD）是人们熟知的一种神经退行性疾病，随着社会老龄化程度加深，患病人数逐年增多。关于AD的假说很多，但其发病机制仍未解析清楚，也没有一种有效的药物治疗手段，所以该领域仍然吸引着众多研究者继续对其进行探究。有许多研究发现，AD病人的神经元中的钙信号机制失常，STIM（stromalinteractionmolecule）蛋白表达量降低，STIM与质膜上Orai蛋白共同介导的钙释放激活的钙（Ca2+release-activatedCa2+,CRAC）信号也下调。CRAC信号是动物细胞中普遍存在的一种重要钙信号产生机制，参与调控基因表达、生长增殖以及衰老死亡等众多生物学过程，其功能的异常与多种疾病密切相关。因而，开发能操纵CRAC信号的工具则具有非常重要的科学和医学意义。光遗传学技术具有时空特异性高、可逆性强及毒副作用小等优点，是操纵钙信号的新兴方式。但目前的光遗传学钙工具存在着钙选择性低、非特异性靶点多、易产生副反应等缺点。美国德州农工大学ZhouYubin教授实验室与北京师范大学王友军教授课题组在之前的研究中开发出了基于STIM的光控钙工具Opto-CRAC。该工具能响应470nm蓝光照射，发生结构改变并激活位于质膜上的特异性钙离子通道ORAI。但Opto-CRAC诱导的钙信号依赖于细胞内源性ORAI蛋白量的表达，在没有ORAI或者ORAI低水平表达的细胞及组织中使用具有局限性。

ZhouYubin教授实验室与王友军教授课题组联合美国德州农工大学HuangYun教授实验室再次合作，经过5年多的不懈努力，于近日共同在NatureCommunications杂志上发表文章，首次设计研发出一种蓝光精准调控并激活的具有高度选择性的钙离子通道LOCa(lightoperatedcalciumchannel)。LOCa是首个四次跨膜的光激活通道，这是在光遗传学领域的一个突破性的进展。研究团队在细胞及个体水平上应用该工具，在不同方面均展现了光开关的LOCa对CRAC相关疾病的治疗作用。

LOCa的主要设计思路是将光敏感蛋白与Orai蛋白结合。但Orai蛋白是一种四次跨膜的六聚体离子通道，直接对其进行改造具有非常大的难度。团队经过多年努力，终于发现将光敏蛋白LOV2插入突变的Orai蛋白TM2与TM3之间的loop区，可以获得最好的效果，保留Orai对钙离子的高度选择性的同时，实现对胞内钙信号的精准调控。

研究团队进一步在细胞水平上，LOCa能够有效抑制癌化造血干细胞的异常自我更新，精准调控靶基因表达以及细胞坏死性凋亡（necroptosis）。个体水平上，研究人员在阿尔兹海默症(AD)果蝇模型中表达LOCa,发现蓝光照射后的AD果蝇攀爬能力得到了增强。研究人员通过光学操纵，有效减轻了果蝇阿尔兹海默症相关症状，这对进一步在哺乳动物实验中验证LOCa对阿尔兹海默症的干预及治疗具有重要的指导意义。以上结果均体现了LOCa在生物工程及生物医学中的潜在应用价值。

图1.LOCa3的光开关反应及在体应用。（A）设计示意图，（B）可逆光控钙信号，（C）AD-LOCa3果蝇设计示意图，（D）蓝光照射对AD果蝇攀爬能力的影响。

美国德州农工大学博士后何涟与北京师范大学博士生王刘清为该研究的共同第一作者；美国德州农工大学的ZhouYubin教授、HuangYun教授，北京师范大学的王友军教授为共同通讯作者。

Engineeringofabonafidelight-operatedcalciumchannel

LianHe,LiuqingWang,HongxiangZeng,PengTan,GuolinMa,SisiZheng,YaxinLi,LinSun,FeiDou,StefanSiwko,YunHuang,YoujunWangYubinZhou

,2021,12,164,DOI:10.1038/s45-4

何涟博士简介

何涟，2018年与美国德州农工大学获得博士学位，2018年至今在美国德州农工大学健康研究中心YubinZhou教授实验室从事博士后研究工作。主要研究包括：光控CRAC通路钙离子释放及信号通路调控；运用光遗传学及化学遗传学等技术手段对新型小分子抗体（包括nanobody,monodody等）进行改造及进化。在Naturecellbiology，NatureCommunications，AdvancedScience和elife等国际顶级期刊上发表研究论文三十余篇，完成4项发明专利。

研究思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：随着光遗传学方法和技术的不断完善和发展，这一技术已经成为神经研究领域不可或缺的研究工具。光敏感离子通道蛋白（Channelrhodopsin-2,ChR2）可以在特定波长的光照刺激下对多种阳离子产生通透性（如H+,Ca2+,K+等）从而通过改变细胞膜电位达到刺激神经元兴奋的目的。但是，在神经细胞中广泛应用的ChR2缺乏离子选择性，限制了其在非兴奋性细胞和组织中的应用。钙作为细胞内信号传递的第二信使，参与了很多重要的生理活动。我们是想开发一种光调控钙特异性激活的光遗传学工具，从而可以在时间上和空间上对钙信号进行调控达到控制相关钙信号通路传导的目的。这也有助于解析“钙密码”，也就是不同钙信号在激活特定生理功能中发挥的作用。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：我们选择了一个钙特异性的离子通道CRAC，想通过对其进行光遗传学的改造实现光调控的目的。但是，CRAC通道是由四次跨膜蛋白ORAI组装成的六聚体结构。和本身是光敏蛋白的ChR2通道不同，我们需要通过对ORAI引入光敏感蛋白实现ORAI的感光。就现有的技术而言，直接在离子通道上进行改造对于我们具有很大的挑战性。光敏蛋白的插入位点，接头序列的长短及类型，是否需要引入ORAI激活突变，这些都是需要考虑的问题。经过合作团队长达5年多的不懈努力，我们最终取得了成功。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助?

A：通过本项研究，我们成功开发出一种蓝光调控的钙特异性的离子通道LOCa。有望利用LOCa对钙信号的开关提供钙失调相关疾病的干预及治疗，例如：免疫缺陷，阿兹海默症，肿瘤。我们相信本研究也会对CRAC通路参与的免疫调控等基础研究，药物研发等起到积极的推动作用。